پاسخ مستقیم: در هر چرخه PCR، ابتدا با افزایش دما دو رشته DNA الگو از هم جدا می‌شوند؛ سپس با کاهش دما، آغازگرهای اختصاصی به توالی‌های مکمل خود روی رشته‌های الگو متصل می‌شوند؛ در مرحله بعد، DNA پلی‌مراز از انتهای آغازگرها نوکلئوتید اضافه می‌کند و رشته‌های تازه را می‌سازد. برای تشخیص مرحله از روی شکل، به جای حفظ یک عدد دما، سه نشانه را دنبال کن: رشته‌ها از هم جدا هستند یا نه، آغازگر وصل شده است یا نه، و رشته تازه در حال بلندشدن است یا نه. دماهای دقیق، نام‌گذاری مرحله‌ها و جزئیات شکل ممکن است میان چاپ‌ها تفاوت داشته باشد؛ کتاب درسی رسمی همان سال مرجع نهایی است.
نقشه مفهومی یک چرخه PCR چیست؟
PCR بخشی مشخص از DNA را بیرون از یاخته و در چندین چرخه تکثیر می‌کند. هر چرخه سه کار پیاپی دارد: جداکردن رشته‌های الگو، فراهم‌کردن نقطه شروع اختصاصی و ساخت رشته مکمل. محصول یک چرخه می‌تواند در چرخه بعد الگو باشد؛ بنابراین تکرار چرخه‌ها تعداد نسخه‌های قطعه هدف را افزایش می‌دهد. برای تحلیل تست، «یک چرخه» را از «کل فرایند چندچرخه‌ای» جدا نگه دار و هر تصویر را در یکی از سه وضعیت قرار بده.
- دناتوراسیون: جداشدن دو رشته DNA الگو.
- اتصال آغازگر: جفت‌شدن آغازگر با توالی مکمل روی الگو.
- طویل‌شدن: افزودن نوکلئوتید به آغازگر و ساخته‌شدن رشته مکمل.
- تکرار چرخه: استفاده از فرآورده‌های پیشین به‌عنوان الگوی چرخه‌های بعد.
در مرحله دناتوراسیون PCR چه اتفاقی می‌افتد؟
در آغاز چرخه، گرم‌شدن نمونه پیوندهای هیدروژنی میان بازهای مکمل را سست می‌کند و دو رشته DNA از هم جدا می‌شوند. اسکلت قند ـ فسفات هر رشته قرار نیست در این مرحله بریده شود؛ پس جداشدن دو رشته را با شکستن پیوندهای کووالانسی در طول رشته یکی نگیر. در شکل، اگر یک مولکول دورشته‌ای به دو رشته منفرد تبدیل شده و هنوز آغازگری روی آن‌ها دیده نمی‌شود، نشانه اصلی دناتوراسیون را داری.
- هدف مرحله، در دسترس قرارگرفتن دو رشته به‌عنوان الگو است.
- پیوندهای میان دو رشته از بین می‌روند، نه ترتیب نوکلئوتیدهای هر رشته.
- DNA پلی‌مراز در این مرحله رشته تازه را طویل نمی‌کند.
- افزایش دما را با افزایش همیشگی فعالیت همه آنزیم‌ها یکی ندان.
مرحله اتصال آغازگر را چگونه تشخیص دهیم؟
پس از کاهش دما، هر آغازگر به بخشی از رشته الگو که با آن مکمل است متصل می‌شود. دو آغازگر در دو سوی قطعه هدف قرار می‌گیرند و مرز ناحیه‌ای را می‌سازند که تکثیر خواهد شد. آغازگر خودش الگو نیست؛ قطعه کوتاهی است که انتهای لازم برای شروع فعالیت DNA پلی‌مراز را فراهم می‌کند. در شکل، رشته‌های الگو همچنان جدا هستند، اما دو قطعه کوتاه روی جایگاه‌های مکمل دیده می‌شوند و هنوز رشته تازه بلندی پس از آن‌ها ساخته نشده است.
- مکمل‌بودن توالی، محل اتصال آغازگر را تعیین می‌کند.
- هر آغازگر روی یکی از دو رشته الگو قرار می‌گیرد.
- جهت قرارگیری آغازگرها باید ساخت DNA را به سوی قطعه هدف ممکن کند.
- اتصال آغازگر به معنی پایان ساخت رشته جدید نیست؛ آغاز طویل‌شدن را آماده می‌کند.
در مرحله طویل‌شدن، DNA پلی‌مراز دقیقاً چه می‌کند؟
DNA پلی‌مراز از آغازگر متصل‌شده شروع می‌کند و نوکلئوتیدهای مکمل رشته الگو را به انتهای رشته در حال ساخت می‌افزاید. چون ساخت DNA جهت‌دار است، در تحلیل پیکان باید انتهای آغازگر و جهت حرکت آنزیم را در نظر بگیری؛ دو رشته الگو ناهم‌سو هستند و ساخت روی آن‌ها در جهت‌های ظاهری مخالف شکل پیش می‌رود. نشانه تصویری این مرحله، ادامه پیداکردن قطعه کوتاه آغازگر به صورت رشته تازه است، نه صرف حضور آنزیم یا نوکلئوتیدهای آزاد.
- آغازگر نقطه شروع و DNA پلی‌مراز عامل طویل‌کردن رشته است.
- نوکلئوتیدهای آزاد، مصالح ساخت رشته‌های مکمل‌اند.
- توالی رشته تازه را مکمل رشته الگو بنویس.
- جهت ساخت را فقط از چپ و راست صفحه حدس نزن؛ قطبیت رشته‌ها را بخوان.
چرا دمای مراحل PCR یکسان نیست؟
هر مرحله به وضعیت مولکولی متفاوتی نیاز دارد. دمای بالاتر باید دو رشته الگو را از هم جدا کند؛ سپس دما باید چنان کاهش یابد که آغازگر بتواند با توالی مکمل خود جفت شود؛ در مرحله طویل‌شدن نیز شرایط مناسب فعالیت DNA پلی‌مراز فراهم می‌شود. بنابراین ترتیب دماها از هدف مرحله‌ها به دست می‌آید، نه از حفظ سه عدد. اگر سؤال عددهای دقیق خواست، فقط جدول یا شکل کتاب درسی رسمی همان سال و داده خود سؤال را مبنا قرار بده.
- بالاترین دمای چرخه معمولاً با جدایی رشته‌ها ارتباط دارد.
- کاهش دما زمینه اتصال مکمل آغازگر را فراهم می‌کند.
- دمای طویل‌شدن را با بهترین شرایط فعالیت آنزیمِ معرفی‌شده در سؤال مرتبط کن.
- از یک عدد حفظی برای همه روش‌ها، آنزیم‌ها یا چاپ‌های کتاب قانون نساز.
یک شکل سه‌قابی PCR را مرحله‌به‌مرحله حل کنیم
فرض کن قاب اول دو رشته جدا و بدون قطعه کوتاه، قاب دوم دو رشته جدا با دو قطعه کوتاه متصل، و قاب سوم همان قطعه‌های کوتاه را همراه با رشته‌های در حال رشد نشان می‌دهد. قاب اول دناتوراسیون است، چون فقط جدایی الگوها دیده می‌شود. قاب دوم اتصال آغازگر است، چون آغازگرها جایگاه شروع را گرفته‌اند اما هنوز طویل نشده‌اند. قاب سوم طویل‌شدن است، چون رشته مکمل از آغازگر ادامه یافته است. اکنون ترتیب دمایی را از همین رویدادها نتیجه بگیر: جدایی با دمای بالاتر آغاز می‌شود، اتصال پس از کاهش دما رخ می‌دهد و سپس شرایط طویل‌شدن فراهم می‌شود.
عبارت‌های تستی مراحل PCR را چگونه بررسی کنیم؟
هر عبارت را به چهار جزء «دما، وضعیت الگو، مولکول متصل و محصول» بشکن. برای نمونه، عبارت «در مرحله اتصال آغازگر، DNA پلی‌مراز دو رشته الگو را از هم جدا می‌کند» دو خطا دارد: جدایی رشته‌ها پیش‌تر و با تغییر دما رخ داده است، و نقش DNA پلی‌مراز ساخت رشته مکمل است نه بازکردن دو رشته در این مرحله. اگر گزینه می‌گوید تعداد قطعه هدف در هر مرحله زیاد می‌شود نیز مرحله را با چرخه اشتباه گرفته است؛ ساخته‌شدن نسخه تازه در طویل‌شدن کامل می‌شود.
- رشته‌های الگو دورشته‌ای‌اند یا از هم جدا؟
- آغازگر پیش از طویل‌شدن به الگو متصل شده است؟
- عامل رویداد تغییر دماست یا فعالیت آنزیم؟
- محصولِ نشان‌داده‌شده رشته تازه است یا فقط اتصال مکمل؟
- عبارت درباره یک مرحله است یا پایان یک چرخه؟
خطاهای رایج در تست‌های PCR کدام‌اند؟
بیشتر دام‌ها از جابه‌جا کردن نقش دما، آغازگر و آنزیم ساخته می‌شوند. شکل را مولکول‌به‌مولکول بخوان و به رنگ یا فاصله ظاهری اجزا تکیه نکن.
- دناتوراسیون را بریدن رشته DNA یا شکستن اسکلت قند ـ فسفات ندان.
- آغازگر را آنزیم، رشته الگو یا محصول نهایی معرفی نکن.
- اتصال آغازگر را با ساخته‌شدن کامل رشته مکمل یکی نگیر.
- جداشدن دو رشته را به فعالیت DNA پلی‌مراز نسبت نده.
- حضور نوکلئوتید آزاد را به‌تنهایی نشانه طویل‌شدن ندان.
- تکثیر قطعه هدف را با تکثیر کل DNA نمونه یکسان فرض نکن.
- هر مرحله را یک چرخه کامل حساب نکن.
- از شکل شماتیک، عدد دما یا تعداد دقیق مولکول نساز.
چک‌لیست ۳۰ ثانیه‌ای تشخیص مرحله PCR چیست؟
برای هر قاب شکل یک ردیف بکش و سه ستون «رشته الگو، آغازگر و رشته تازه» را علامت بزن. دو رشته جدا بدون آغازگر یعنی دناتوراسیون؛ آغازگر متصل بدون رشته بلند یعنی مرحله اتصال؛ ادامه رشته از آغازگر یعنی طویل‌شدن. در پایان، جهت ساخت و ترتیب قاب‌ها را با پیکان کنترل کن.
- تعداد و وضعیت رشته‌های الگو را دیده‌ام؟
- قطعه کوتاه آغازگر را از رشته تازه تشخیص داده‌ام؟
- رشته تازه از انتهای آغازگر ادامه پیدا می‌کند؟
- نقش دما و DNA پلی‌مراز را جابه‌جا نکرده‌ام؟
- جهت ساخت با ناهم‌سویی دو الگو سازگار است؟
- مرحله را از چرخه و کل فرایند جدا کرده‌ام؟
- جزئیات دما و شکل را با کتاب درسی رسمی همان سال سنجیده‌ام؟
برای تشخیص مراحل PCR سه تصویر ذهنی کافی است: دو رشته جدا = دناتوراسیون؛ آغازگر کوتاهِ متصل به هر الگو = اتصال آغازگر؛ ادامه‌یافتن رشته از آغازگر = طویل‌شدن. دما را از هدف هر مرحله تحلیل کن، نقش آغازگر را با نقش DNA پلی‌مراز جابه‌جا نکن و عددها و جزئیات وابسته به چاپ را از کتاب درسی رسمی همان سال بخوان.
در نکته‌های وابسته به جزئیات، متن و شکل کتاب درسی رسمی همان سال را مبنا قرار بده.